식물 세포 현탁 배양은 식물 세포나 작은 세포단을 액체 배양기에 매달아 배양 과정에서 좋은 분산성을 유지하는 것을 말한다. 식물 체외 배양은 캘러스를 생산할 수 있다. 느슨한 치유 조직은 액체 배양기에 떠 있어 진동 조건 하에서 일정 기간 배양한 후 분산된 공중부양 배양물을 형성할 수 있다. 좋은 현부배양은 다음과 같은 특징을 가져야 한다. (1) 주로 단세포와 소세포단으로 이루어져 있다. (2) 세포는 성장 분열 능력이 풍부하고 증식 속도가 빠르다. (3) 대부분의 세포는 형태적으로 분생 조직 세포의 특징을 가져야 한다. 대부분의 등직경, 핵질량은 크고, 세포질은 촘촘하며, 비정수체의 정도는 낮다.
액체 현탁 배양 과정에서 세포의 계대 배양에 주의를 기울여야 한다. 배양물이 일정 기간까지 자라면 분열의 정지 단계에 들어갈 수 있기 때문이다. 대부분의 공중부양 배양의 경우 세포는 18 ~ 25 일 동안 최대 밀도에 이르며, 이때 1 차 계대 배양을 해야 한다. 전대 배양에서는 더 큰 세포단과 접종물 잔여물을 제거해야 한다. 식물 기관이나 조직에서 세포 현탁 배양 시스템을 구축하면 캘러스 유도, 계대 배양, 단세포 분리 및 현탁 배양이 포함됩니다. 현재 이 기술은 세포 형태, 생리학, 유전, 시들어가는 연구, 특히 유전자 공학이 식물 세포 수준에서 작동하는 데 이상적인 재료와 경로를 제공하고 있다. 변환된 식물 세포를 분화시켜 식물을 형성하고, 목적 유전자를 가지고 있는 개인을 얻는다.
주요 시약:
B5 배양기에 0.2mg NAA (아세틸산) 액체 배양기 (3.2g B5 분말 배양기, 30g 사탕수수, 200ul 부피질량이 65438±0mg/ml 인 NAA 원액, 약 800ml 증류수, 자력 믹서에 섞어서 섞는다. 1mol/l KOH 로 pH 값을 5.8 로 조정하고 증류수를 1L 로, 알루미늄 호일로 밀봉하고,121
주요 장비:
1. 정화대
2. 가압 탱크
3. 회전 진동기
4. 욕조
5. 거꾸로 현미경
6. 족집게
알코올 램프
8. 삼각병
9. 피펫
10.pH 미터
1 1. 항온 배양실
12. 굴뚝
13. 스테인레스 스틸 스크린
14. 혈구 계수판 등.
실험 재료:
Arabidopsis 캘러스
실험 단계:
1. 족집게로 왕성하고 부드러운 뇌량을 꺼내서 삼각병에 넣고 가볍게 부수세요. 각 100ml 삼각형 병에는 10~ 15ml 멸균 배양기, 병당 접종1~1이 들어 있습니다.
2. 접종한 삼각형을 회전흔들기 위에 놓습니다. 65438 000 회전/분, 25 ~ 28 C 조건에서 쉐이크 병 배양을 합니다.
3. 배양 6~ 10 일 후 세포 증식이 뚜렷하면 배양병에 10ml 신선한 배양기를 넣고 필요한 경우 큰 빨대로 배양물을 두 병으로 나누어 계속 배양한다. (세포가 눈에 띄게 증식하지 않으면 시작 재료가 적합하지 않을 수 있으므로 왕성한 증식기에 캘러스를 다시 접종하는 것을 고려해야 한다.) 1 차 계대 배양을 할 수 있다.
4. 현탁 배양의 여과:' 3' 법에 따라 대대로 배양된 후 배양액은 주로 단세포와 소세포단 (20 개 이하의 세포) 으로 구성되어야 한다. 효과적인 대세포단도 포함되어 있다면 적절한 구멍 지름의 금속망체로 걸러낸 다음, 여과된 현내 떠다니는 세포를 계속 배양할 수 있다.
5. 세포 계산. 일정 부피의 세포액을 취하여 부피의 8% 삼산화 크롬 (CrO3) 을 두 배로 넣어 70 C 수욕에서 65438±05min 에 넣는다. 냉각 후, 이동액관으로 세포 현액을 반복해서 불어서 세포가 완전히 분산되게 한다. 혼합한 후 현액 한 방울을 취하여 혈구 계산판에 넣어 세어라.
6. 세포 성장곡선 만들기: 현성의 떠 있는 배양세포의 성장역학을 이해하기 위해 다음과 같은 방법으로 성장곡선을 그릴 수 있다.
1) 선중법은 전대 배양의 시간에 따라 일정한 부피의 공중부양배양물을 취하고, 원심수집 후 무게를 재어 세포의 신선한 무게를 세로좌표로 하고, 배양시간을 가로좌표로 하여 신선한 무게의 성장곡선을 그린다.
2) 건중법은 신선한 무게를 재본 후 세포를 건조시킨 다음 무게를 재어 건중량을 측정할 수 있다. 건중량을 세로좌표로, 배양 시간을 가로좌표로 하여 세포 줄기세포 재생 곡선을 그리다.
위의 두 가지 방법은 이틀에 한 번, * * * 7 회, 샘플당 세 번 반복해야 합니다. 전체 실험 과정에서 신선한 배양액이 배양병으로 교체되지 않았다.
7. 세포 활력 검사. 초심자에게는 살아있는 세포의 비율을 검사해야 하는 경우가 많다. 배양의 여러 단계에서 세포액 한 방울을 흡수해 슬라이드 위에 놓고 0 방울을 떨어뜨릴 수 있다. 1% 페놀 사프란 용액 (배양기로 준비) 으로 염색하고 현미경으로 관찰한다. 몇몇 살아있는 세포는 착색되지 않고, 죽은 세포는 곧 붉은색으로 물들었다. 0 도 사용할 수 있습니다. 1% 형광 이초산염 용액으로 염색하면 모든 살아있는 세포가 자외선에 의해 유도되는 파란색 형광을 띠며, 경험이 있는 작업자는 세포 형태와 세포질 순환에 따라 세포의 생사를 판단할 수 있다.
8. 세포 재생능력의 감정: 공중부양배양된 세포가 재생능력이 있는지 알기 위해 배양된 세포를 한천 경화된 배양기로 옮겨 기저부가 다시 캘러스를 형성하게 한 다음 분화 배양기에서 식물의 분화를 유도할 수 있다.
참고 사항:
1. 위의 단계는 모두 멸균이며, 배양기, 그릇, 용구는 모두 고압 멸균을 한 후에야 사용할 수 있다.
2. 배양기가 탁하거나 유백색이면 이미 오염된 것이다.
3. 각 전대 배양 과정에서 배양물의 각종 세포와 기타 잔여물을 거꾸로 현미경으로 관찰하고 의식적으로 원형 세포를 남기고 긴 세포를 버려야 한다.