DNA 중합효소는 PCR 반응에 없어서는 안될 성분이자 DNA 복제에 관여하는 중요한 효소로 생물학, 의학 분야에서 다양한 연구 방향으로 활용되고 있습니다. PCR 기술이 발명된 지 40여년 동안 효소는 Taq DNA 중합효소의 초기 발견부터 현재에 이르기까지 점점 더 다양해지고 있습니다. 새로운 효소의 발견과 기존 효소의 변형으로 DNA 중합효소의 충실도, 특이성, 민감도 등이 크게 향상되었습니다.
고충실도 DNA 중합효소에는 중합센터와 효소절단센터가 있습니다. , 중합 중심은 5'→3' DNA 중합효소 활성을 가지며 5'→3' 방향으로 DNA 합성을 촉매할 수 있으며, 효소 절단 중심은 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지며 염기 불일치를 복구할 수 있습니다. 일반적인 고충실도 DNA 중합효소 유형에는 Pfu, KOD 등이 포함됩니다.
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그림 2. DNA 중합효소의 작동 원리[2]
고충실도 효소를 선택하는 방법
시퀀싱, 유전자 기능 연구, 단백질 발현, 부위 지정 돌연변이 유발 등의 경우 다양한 앰플리콘의 안정적인 증폭을 보장하기 위해 고충실도 증폭이 매우 중요합니다. 시퀀싱 라이브러리 증폭 프로세스를 예로 들면, 시퀀싱 프로세스 중 돌연변이는 시퀀스 스플라이싱에 어려움을 야기할 수 있으며 저주파 검출이 필요한 일부 분석 결과를 방해할 수도 있습니다. 시중에는 다양한 종류의 고품질 DNA 중합효소가 있으므로 적합한 효소 제품을 선택하는 것이 매우 필요합니다. 시중에 나와 있는 일반적인 고충실도 효소 특성에는 주로 충실도, 증폭률, 특이성, U 저항성 등이 포함됩니다.
충실도(Fidelity): 불일치율은 고충실도 DNA 중합효소의 충실도를 계산하는 일반적인 표준입니다. 불일치율이 낮을수록 충실도는 불일치율의 역수로 표현되는 경우가 많습니다. (충실도 = 1/불일치율) 측정 방법에 따라 결과도 달라집니다. 세 가지 일반적인 감지 방법이 있습니다:
감지 방법
감지 원리
장점과 단점
청백색 반점 스크리닝 분석
p >
β-갈락토시다제 유전자 활성을 복원하고 파란색 콜로니를 생성할 수 있는 lacZ 유전자를 증폭하기 위해 DNA 중합효소를 사용하면 청백색 반점 스크리닝 결과와 결합하여 충실도를 평가할 수 있습니다.
빠르고 비교적 간단하며 비용 효율적이지만 정확도가 높지 않고 DNA의 동의어 돌연변이를 구별할 수 없습니다.
1세대 시퀀싱
PCR 증폭 산물을 해당 벡터에 클로닝하고, 형질전환된 단일 콜로니에 대해 Sanger 시퀀싱을 수행하여 시퀀싱 결과에서 일치하지 않는 뉴클레오티드의 수를 확인합니다. 그 충실도.
정확도가 높고 모든 변이를 검출할 수 있지만 작업량과 비용이 상대적으로 높다.
NGS 시퀀싱
NGS 플랫폼을 사용하여 PCR 증폭 후 해당 처리된 라이브러리 산물을 시퀀싱하고 분석하여 DNA 중합효소 증폭 과정에서 정확도를 계산합니다.
정확도가 높고 DNA 돌연변이를 검출할 수 있습니다. 그러나 시퀀싱 플랫폼 자체에는 특정 오류율이 있으며 읽기 길이가 제한됩니다.
Yisheng은 안정적인 성능을 지닌 다양한 고충실도 DNA 중합효소를 보유하고 있습니다. 그 중 Hieff Canace™ Plus High-Fidelity DNA Polymerase(Cat#10153, Canace plus로 지칭)는 Taq 효소의 83배, Pfu 효소의 9배에 달하는 최고 수준의 충실도를 가지고 있습니다.
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그림 3. Canace plus의 충실도
증폭율: 합성 능력은 고충실도 DNA 중합효소를 평가하는 데 매우 중요한 요소입니다. 원래의 고성능 DNA 중합효소는 강력한 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성으로 인해 합성 능력이 낮습니다.
예를 들어, Pfu DNA 중합효소의 합성 속도는 Taq DNA 중합효소의 절반에도 미치지 못하지만, Hieff Canace 시리즈의 high-fidelity 효소는 유전자 변형을 통해 중합 능력을 크게 향상시켰습니다. Cat#10153, 줄여서 Canace plus) 증폭 속도는 10초/kb에 도달할 수 있습니다.
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그림 4. Canace plus의 증폭률은 10초/kb 정도로 낮습니다. Canace plus는 50ng, 35주기, M: 1kb DNA 마커의 주형 입력을 사용하여 쌀 gDNA의 2kb 단편과 마우스 gDNA의 4kb 단편을 각각 증폭했습니다.
특이성: 저온에서 고온으로 PCR 증폭 과정에서 효소의 활성이 약해 쉽게 불일치가 발생하거나 프라이머 다이머가 형성될 수 있습니다. 이러한 비특이적 증폭은 PCR의 품질을 크게 저하시킵니다. 제품. 이러한 현상의 발생을 줄이기 위해 증폭의 특이성을 확보하기 위해 신장을 시작하기 전에 효소를 인위적으로 불활성화할 수 있습니다. 이 방법은 효소의 핫 스타트(hot start)라고도 설명됩니다. Hieff Canace™ Plus High-Fidelity DNA Polymerase(Cat#10153)는 hot-start 특성을 가지며 높은 특이성, 높은 감도 및 높은 수율을 특징으로 합니다.
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그림 5. Canace plus는 증폭 성능이 좋습니다. Canace plus(A)와 시판되는 고충실도 효소(경쟁사 1-B, 경쟁사 2-C)를 사용하여 마우스 gDNA 4kb, M: 1kb DNA 마커를 증폭했습니다.
U-저항성 여부: Pfu 교정 DNA 중합효소는 dUTP와 호환되지 않으며 메틸화 라이브러리 구축 또는 부위 지정 돌연변이 유발이 적용되기 전에 우라실을 견딜 수 있도록 특별히 변형되어야 합니다. Hieff Canace® Uracil High-Fidelity DNA Polymerase(Cat#10145)는 Hieff Canace가 우라실 함유 주형을 위해 설계한 high-fidelity DNA 중합효소로, 메틸화 라이브러리 수율을 기준으로 증폭 성능이 매우 우수함을 알 수 있습니다.
샘플 유형
메틸화 라이브러리 구축
U-저항성 고충실도 폴리머라제(동일 단위 추가)
Yeasen
K*
입력 DNA(ng)
4.5
증폭 주기(주기)
7
p>평균 수율(ng)
26.3
17.9
Yisheng High-Fidelity DNA Polymerase 선택 가이드
제품 포지셔닝
제품명
품번
주요 응용 프로그램
초고음질
Hieff Canace? Fidelity DNA Polymerase
10153ES
분자 클로닝
U 템플릿을 포함하는 증폭
Hieff Canace? Uracil High-Fidelity DNA Polymerase? > p>
10145ES
메틸화 템플릿 증폭
고효율 및 고충실도
Hieff Canace? Pro 고충실도 DNA 중합효소
13476ES
고효율 시퀀싱
Qamp; A
1. Q: 충실도가 높은 DNA 중합효소 증폭 제품에는 무딘 말단이 있습니다. 2세대 시퀀싱 라이브러리 구축) 제품 끝에 A를 어떻게 추가하나요?
A: Taq DNA 중합효소(Yeasen Cat#13486)의 deoxynucleotidyl transferase 활성은 PCR 산물의 3' 말단에 뉴클레오티드 "A"를 추가할 수 있으며, 실험 조건은 해당 내용을 참고하시기 바랍니다. 제품 설명서.
2. Q: 다양한 고성능 DNA 중합효소 제품의 충실도가 비슷합니까?
A: 회사마다 정확도를 측정하는 방법이 다르고 결과도 다릅니다. 효소의 정확도는 동일한 방법으로 서로 비교해야 합니다.