포유류의 핵 이식은 줄곧 주목을 받고 있다. 포유류의 수정란이 매우 작기 때문에 체외 배양과 핵 이식 기술은 모두 매우 어려워서 198 1 년이 되어서야 IIImensee 와 Hoppe 가 처음으로 성공을 보도했다. Mcgrath 와 Solter 는 1983 에서 핵이식 기술과 세포 융합을 결합하는 방법을 발표해 이식 알의 90% 이상을 배아기로 배양할 수 있다. 배아 이식 후 핵 이식 마우스의 일정 비율을 얻을 수 있습니다.
본 실험은 개구리와 포유류를 실험 재료로 핵 이식 기술을 소개했다.
실험기술
1. 개구리의 핵이식 (그림 17.438+0)
(1) 수용체 알의 제조
1. 박막 제거:
성숙한 개구리 알을 인공으로 재촉하다. 성숙한 개구리 알을 짜내고, 하나씩 난막을 제거한 다음, 알을 고온멸균된 페트리 접시에 가지런히 배열하여 접시 바닥에 붙이게 한다. 난동물을 극도로 위로 올려서 자극을 받고 핵을 고르게 합니다. 그런 다음 적당량의 수술액을 넣고 한 번에 페트리 접시에 계란 25 ~ 40 개를 배열한다.
2. 흥분:
개구리 알은 여전히 수정 전 두 번째 성숙 분열의 중기에 있다. 난자의 두 번째 성숙한 분열을 완성하기 위해 제 2 극체를 배출하고 쌍안 해부경 아래 멸균된 유리로 동물을 찔러 적도에 매우 가까운 부위를 찔러 자연 수정 시 정자가 난자에 들어가는 과정을 대신한다. 침침 동작이 정자보다 난자에 들어가는 속도가 훨씬 빠르기 때문에, 침침 조작은 부드러워야 한다. 발생된 난자는 10- 15 분 후에 제 2 극체를 생성합니다. 해부학 현미경에서, 우리는 동물의 극 근처에 굴절된 구가 있는 것을 볼 수 있는데, 이것은 제 2 극극체이다.
3. 검사:
제 2 극체가 나타나면 소독한 유리 바늘을 극체의 난면에 비스듬히 삽입한 다음 난끝을 빠르게 들어올립니다. 난황막이 파열되어 극체 아래의 난핵이 작은 세포질을 가지고 난외구를 형성하여 극체가 15 분 후에 점차 사라질 것이다. 이렇게 발췌한 핵은 극체가 나온 후 10 분 안에 완성해야 한다. 그렇지 않으면 핵이 난의 중심에 가라앉아 핵제거 조작이 쉽지 않다.
4. 필름을 다시 제거합니다.
핵을 골라낸 후 약 65,438+00 분 정도 걸립니다. 상처가 기본적으로 아물면 날카롭게 갈아진 시계 족집게 두 개로 난외 필름은 수정막이 남아 있을 때까지 서서히 벗겨진다. 작업 단계는 다음과 같습니다. 쌍안 해부경에서 먼저 뾰족한 핀셋 한쪽의 끝을 계란 접시 아래쪽에 있는 필름에서 가장 안쪽 필름에 조심스럽게 삽입한 다음 캡슐을 잡고 계란을 고정시킨 다음 다른 핀셋으로 계란 반대쪽에서 필름을 잡고 필름을 위로 들어올립니다. 두 개의 족집게가 왼쪽에서 오른쪽으로 당기면 난자가 손상되기 쉽고 난자가 탈구되어 배아 발육에 영향을 미친다.
껍질을 벗긴 알을 수술 용액이 들어 있는 페트리 접시에 옮겨 유리판에 핵 주사를 놓는다.
(2) 기증자 세포의 분리
배반포 또는 초기 원생 배아의 외배층을 기증자 세포로 취하다. 먼저 여과지에서 접착제를 제거한 다음 페트리 접시에 옮깁니다. 페트리 접시의 바닥에는 한천 층이 코팅되어 분리액이 들어 있습니다. 두 개의 족집게로 배아 밖에 남아 있는 여러 층의 접착제를 벗겨 외부 배아층을 잘라 사용하지 않은 배아 부분을 빨아들입니다. 작은 조직을 분리액에 몇 분 동안 넣고 가볍게 흔들면 세포가 스스로 분산될 수 있다. 흩어지지 않으면, 모세관 빨대로 가볍게 불어도 된다.
모세 빨대를 통해 분산 배아 세포를 외과 용액이 있는 페트리 접시로 옮기고 이식 중 기증자 세포로 바르는 한천을 칠한 작은 슬라이드 위에 놓는다.
(3) 핵 이식
1. 미량 주사기의 제조:
매번 작동하기 전에 미량의 주사기의 전체 배관 시스템은 수술액이나 이중 증기로 가득 차 있어야 하며, 런의 연결부에서 공기가 새지 않는지 점검해야 한다. 튜브 안에 작은 기포가 있는 한 주사기 조정은 실패할 것이다. 또한 스프링이 비교적 예민한 부분을 선택하여 정확하게 조작해야 합니다 (그림 17.2, 17.3, 17.4).
2. 마이크로 피펫 준비:
빨대는 부드러운 유리관을 사용하는 것이 가장 좋다. 제작하기 전에 세제로 유리관을 씻은 다음 증류수로 철저히 헹구세요. 이렇게 하면 추출한 미량이동기 내부를 깨끗하게 하여 핵의 흡입과 배출에 영향을 주지 않는다. 유리관을 지름이 1mm 인 튜브로 당긴 다음 마이크로불꽃에서 지름이 10-20 미크론인 마이크로피펫으로 당깁니다 (그림 17.5,/Kloc-0)
3. 흡입 핵:
핵을 빨아들이는 방법은 미량빨대 머리를 기증자 세포에 찔러 핵을 빨아들이는 것이 아니라 마이크로콘솔에서 미크론 지름을 가볍게 돌려 한 세포를 미량빨대로 천천히 들이마시는 것이다. 미량의 빨대의 내경이 세포의 내경보다 작기 때문에 흡입된 세포는 흡입력으로 인해 파열될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 이렇게 되면 세포핵을 세포핵 주위의 일부 세포질과 함께 튜브에 흡입하여 액체와의 직접적인 접촉으로 인한 손상을 방지할 수 있습니다. 또한 핵주사 과정에서 더 많은 수술액을 가져오지 않도록 공급체세포가 가능한 구멍에 가까이 있도록 조정해야 한다.
4. 참고:
공급체핵이 있는 미량이동기를 동물의 반구 중심에 삽입하고, 동물에서 약 45 도 정도 떨어진 다음 노즐을 약간 위로 올리고, 미량이동기를 가볍게 밀어 주변의 세포질이 있는 시험관 안의 핵을 천천히 난자에 주입한다. 주사 속도가 너무 빨라서 계란에 주입되는 압력이 너무 높으면 계란이 깨지고 실험이 실패합니다.
보통 1 차 껍질을 벗기고 주사 15 핵까지 약 2-2.5 시간이 걸리며 이식란의 발육에 영향을 줍니다.
5. 재배 관찰:
핵 이식 후 알을110 홀트액으로 옮겨 25 C 의 인큐베이터에서 배양한다. 난자의 발육 상황을 제때에 관찰하고 기록을 잘 한다.
6. 기존의 인공수정을 통해 같은 알에서 수정란을 얻어 같은 온도에서 페트리 접시에 배양하여 전이된 알과 비교한다.
둘째, 포유류 핵 이식
1. 계란 가져 오기:
계란 채취 방법은 실험 16 과 같다.
2. 핵 제거 계란 만들기:
쥐의 수정란을 수용체로, 차이 간섭 장치가 있는 현미경으로 미리 준비한 핵이식 바늘의 끝을 수정란의 투명대까지 찔러 바늘이 투명대만 통과하고 난자의 질막을 뚫지 않도록 한다. (알버트 아인슈타인, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 수정란, 수정란, 수정란, 수정란 등) 그런 다음 바늘을 수컷에게 겨누고 질막을 통해 주사기를 흡입한다. 그런 다음 바늘을 암컷에게 겨누고, 같은 방법으로 암컷과 수컷의 원핵을 바늘의 앞쪽으로 빨아들인 다음, 주사기를 천천히 뽑는다. 이때 우리는 난자의 질막 탄력이 매우 크다는 것을 알 수 있다. 질막은 노즐과 투명대 사이에서 가는 실로 당겨져 깨지고, 침관 안에 세포질과 두 개의 원핵과 소량의 세포질만 있는 두 부분으로 이루어진 핵난을 형성하고, 질막은 바깥에 둘러싸여 있다. (알버트 아인슈타인, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 세포명언) 핵을 제거한 난자를 수용체로 삼다 (그림 17.7).
3. 핵 이전:
같은 방법으로 기증자인 검은 쥐 수정란의 암컷, 수컷의 원핵 흡입관, 소량의 불활 타오르는 센다이 바이러스를 들이마신 다음 바늘관을 핵란으로 이동시켜 노즐이 투명대 원래의 작은 구멍을 통과해 난주 틈으로 들어가게 한다. 이때 주사기를 살살 돌려 외질막으로 둘러싸인 암컷, 수컷 원핵, 센다이 바이러스가 수용체란의 투명대와 질막 사이의 난주 공간으로 함께 들어가도록 한 다음 주사기 (그림 654) 를 천천히 빼면 바이러스의 작용으로 세포핵질막이 핵질막과 핵막과의 접촉으로 옮겨져 질막이 서서히 녹고 암수 원핵이 수용체알의 융합 과정으로 들어가는 것을 볼 수 있다. 전이된 난자는 사실 핵교배이다. 수술이 성공하면 이산화탄소 배양함에서 배양하면 난자의 90% 이상이 배아단계로 발육하여 배아 이식을 할 수 있다.
핵 이식을 받을 수 있는 핵잡종 쥐.
핵 이식의 전 과정에서 모든 단계는 세포막, 세포질, 세포핵에 대한 손상을 최소화하기 위해 엄격하게 조작해야 하며, 사용하는 기구도 엄격하게 소독하여 오염을 방지하고 각 단계의 생존율을 높여야 한다.
실험 재료
1. 실험 재료:
개구리 수정란, 개구리 배반포 말기 또는 원장 배아, 쿤밍백쥐, 검은 쥐 (C57BL-6).
실험 장비:
마이크로 로봇, 마이크로 주사기, 주사기, 알코올 스프레이, 홍채 가위, 뾰족한 시계 집게,
0.5cm, 0.3cm 유리관, 1mm 유리 모세관, 유리침, 페트리 접시, 엘보우 이동관, 모세관 이동관, 미량이동관, 배양함, 쌍안 해부기, 현미경.
실험 약물:
수술액: 홀트프레트액, 삶은 소독이 필요합니다.
분리액:
염화나트륨 0.35 그램
KCl 0.005
이중 증기선 100ml
끓임, 소독, 냉각 후 혼합물을 넣는다.
에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 18.6 밀리그램
중탄산 나트륨 0.02 그램
링거 (용해) 액
알코올 70%
2% 한천